科学研究

科研进展

罗敏敏实验室开发神经元稀疏标记方法实现全脑范围单细胞重构

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2018-11-20


视频1:fMOST神经元重构流水线

北京时间2018 年11月20日,本中心罗敏敏课题组在《Nature Methods》杂志上在线发表题为“Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons”的文章。该研究开发了一套基于腺相关病毒(AAV)载体的稀疏高亮标记方法。利用此方法,研究人员在fMOST成像系统的帮助下实现了全脑范围单神经元完整重构;并展示了透明化脑片的中间神经元快速重构的方法。


稀疏标记的历史由来已久。1873年,意大利生物学家Camillo Golgi发明了高尔基银染法,首次在组织切片中实现了神经元的稀疏标记。随后,Santiago Ramón y Cajal使用该方法精细刻画了神经元的结构,提出了神经元学说,标志了现代神经科学的开端。自此之后,稀疏标记的方法不断被改进发展,用于研究神经系统中神经元的结构和连接方式。但截止到目前为止,现有的稀疏标记方法仍面临多个问题:无法实现足够的标记信噪比,无法有效控制稀疏程度,流程繁琐不易使用等等。另一方面,传统的组织切片方法只能在神经组织的二维平面中刻画神经元的结构,丢失了大量空间信息,神经科学研究亟需新的技术实现对脑结构的高精度、高通量成像,并用特殊图像处理技术在三维空间中对神经元进行重构。

针对第一个问题,罗敏敏实验室开发了一种基于AAV的表达系统,可以稀疏、高亮地标记特定类型的神经元。这一标记系统由两个AAV载体两组成:1)控制子(Controller),由TRE启动子与Cre依赖的转录模块组成。Cre依赖的转录模块中包含3’-5’反向的FLPo编码序列;2)放大子(Amplifier),由TRE启动子和FLP依赖的转录模块组成。FLP依赖的转录模块中包含3’-5’反向的GFP-IRES-tTA编码序列(图1左)。

这两个病毒需混合后进行脑内注射。混合病毒侵染神经元后,若神经元内无Cre表达,则标记不发生。当病毒感染Cre阳性神经元后,控制子中的Cre依赖的转录元件会被翻转。由于此时神经元内没有tTA表达,TRE启动子转录活性低。在大多数被病毒侵染的Cre阳性神经元中FLPo表达量极低,无法触发放大子中FLP依赖的转录模块的翻转。随机的,在某些Cre阳性神经元中,FLPo表达量达到一定的水平,触发放大子中FLP依赖的转录模块的翻转。由于放大子同样使用TRE启动子,转录活性低,只有少量的GFP和tTA表达。此时,在极少量细胞内tTA的表达量达到一定水平,足以结合TRE启动子并启动其后基因的转录,正反馈回路被触发:细胞表达更多的FLPo对剩余的放大子组件进行翻转,并使更多的GFP和tTA被表达出来,标记强度得到增强(图一右)。

该系统的设计有两个优点:1)由于标记的触发依赖于Cre,通过将该稀疏标记系统与Cre转基因小鼠联用,能够实现细胞类型特异性的稀疏标记;2)通过调整控制子和放大子的混合比例,能够控制标记的稀疏程度。

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图一 稀疏标记系统工作原理


基于这一标记系统,罗敏敏课题组与华中科技大学国家光电研究中心fMOST课题组合作,建立了“稀疏标记-样本包埋-fMOST成像-神经元重构-数据校准-量化分析”的流水线,实现了稳定高通量的全脑成像和图像分析。借助这一流水线,研究人员在DAT-Cre小鼠中重构了15个中脑多巴胺神经元的完整形态。通过单细胞形态学分析,研究人员能够将重构的多巴胺神经元分为两类:一类多巴胺神经元只有单个投射目标,轴突在终点处会形成密集的末端树状分支(图二左);另一类投射轴突分布比较广泛,会有多个旁分支投向不同目标,少有末端树状分支(图二右)。

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图二 15个多巴胺神经元的全脑投射形态重构


神经元的类型可以通过多因素进行刻画,其中之一是投射特异性。为了实现对投射到特异终点脑区神经元的稀疏标记,研究人员将Cre蛋白序列包装入AAV-retro血清型的病毒,借助其逆向传递感染的特点,实现投射特异性的神经元稀疏标记。研究人员选择针对一种已知投射特征的神经元:皮层-纹状体神经元进行标记。皮层-纹状体神经元基于投射特征可分为两类:端脑内神经元(Intratelencephalic neuron,IT)投向双侧纹状体,而对中脑及其向后脑区域没有投射;锥体束神经元(Pyramidal tract neuron,PT)轴突具有同侧纹状体投射,且对中脑、后脑亦有广泛投射。研究人员设计了实验对这两类神经元分别进行标记:将稀疏标记病毒注射到鼠脑皮层ACC脑区的一侧,并在同侧或对侧纹状体注射AAV-retro-Cre。鼠脑由fMOST系统成像并进行了神经元重构。重构完成后,研究人员确实观察到同侧注射病毒的鼠脑特异性标记了锥体束神经元,而对侧注射病毒的鼠脑只标记了端脑内神经元。这一结果验证了投射特异性神经元标记策略切实有效(图三)。

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图三 投射特异性标记策略实现皮层-纹状体PT/IT神经元完整形态重构


组织透明化是近期成像领域屡有突破的技术。研究人员将稀疏标记系统与组织透明结合,在PV-Cre和SOM-ires-Cre小鼠中特异性的标记了两类中间神经元,制成脑片后用uDISCO方法进行透明化处理。随后在共聚焦显微镜下成像,并对对神经元进行了重构。通过此方法,研究人员实现了中间神经元的快速重构,并且可以高效地对神经元树突的分支特征进行量化分析(图四)。

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图四 稀疏标记策略与组织透明结合,实现中间神经元重构


该稀疏标记系统的另一大优点是可拓展性高。最初版本的稀疏标记系统中,研究人员利用了Cre和FLP这一对重组酶。通过引入新的重组酶,理论上可以构建与Cre/FLP版本相正交的新版本稀疏标记系统,以实现在同一样本内对不同种类神经元的多色标记。为了验证此策略,研究人员引入了DreO和vCre这一对新的重组酶,构建了DreO/vCre版本的稀疏标记系统(图五左)。利用Cre/FLP和DreO/vCre两个版本的稀疏标记系统,研究人员成功实现在同一鼠脑内对两群神经元进行双色稀疏标记(图五右)。

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图五 引入正交重组酶实现多色稀疏标记


相比于现有的稀疏标记方法,罗敏敏课题组开发的这一稀疏标记策略具有易使用、易拓展、效率高的特点。除了文章中展示的分子特异性或投射特异性标记,理论上该系统也可以与光遗传学分子、分子探针、CRISPR/Cas9元件等联用,用于单细胞水平功能性研究。这一技术的开发将有助于将脑连接谱研究推向单细胞精度,并有希望帮助研究人员在单细胞精度下对正常及病理状态的神经元进行研究。

本中心罗敏敏实验室林睿博士、PTN项目博士生王睿宇以及华中科技大学国家光电研究中心袁菁博士为本文的共同第一作者,其他作者包括罗敏敏实验室冯琦茹、周宥彤,华中科技大学国家光电研究中心曾绍群博士、任淼博士、博士生蒋思齐、倪鸿、周灿。我所罗敏敏博士及华中科技大学龚辉教授为本文共同通讯作者。该研究由科技部973、国家自然科学基金委及北京市政府资助。


文章链接:https://www.nature.com/articles/s41592-018-0184-y